/  導(dǎo)讀  /

2022年7月，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院張旻教授團(tuán)隊(duì)與華盛頓大學(xué)、福州肺科醫(yī)院專家在Frontiers in Cellular and Infection Microbiology（IF=6.073）雜志發(fā)表了一篇前瞻性研究，通過(guò)群體感應(yīng)(QS)系統(tǒng)評(píng)估、全基因組測(cè)序（WGS）、進(jìn)化實(shí)驗(yàn)等方法，評(píng)估非囊性纖維化支氣管擴(kuò)張（NCFB）患者在慢性銅綠假單胞菌肺部感染過(guò)程中是否會(huì)產(chǎn)生lasR突變的耐藥選擇并闡述其機(jī)制。迪飛醫(yī)學(xué)作為共同作者參與了該研究的數(shù)據(jù)分析。

/  研究背景  /

銅綠假單胞菌是一種常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌，可引起非囊性纖維化支氣管擴(kuò)張(NCFB)患者的慢性感染并釋放多種毒力因子，導(dǎo)致發(fā)病率升高、生活質(zhì)量下降和治療負(fù)擔(dān)增加。因銅綠假單胞菌對(duì)抗生素的顯著耐藥性，要根除它已經(jīng)變得越來(lái)越困難。

多重耐藥（MDR）的發(fā)展可以影響銅綠假單胞菌分離株的進(jìn)化和適應(yīng)，并促進(jìn)其成為慢性感染患者的頻繁定植者。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)菌的某些生理系統(tǒng)功能可能會(huì)發(fā)生改變，群體感應(yīng)(QS)就是其中之一。銅綠假單胞菌利用QS系統(tǒng)，以依賴細(xì)胞密度的方式調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)，其中許多基因編碼分泌毒力因子，如蛋白酶、彈性蛋白酶、氰化氫和吩嗪，這使得QS系統(tǒng)組分成為抗毒治療的潛在靶點(diǎn)。QS系統(tǒng)由許多小信號(hào)分子介導(dǎo)，包括N -3-氧-十二烷基高絲氨酸內(nèi)酯(3OC12-HSL)和N-丁醇-高絲氨酸內(nèi)酯(C4-HSL)，這兩個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分層激活LasR-LasI系統(tǒng)和RhlR-RhlI系統(tǒng)。3OC12-HSL是LasI合酶的產(chǎn)物，當(dāng)其環(huán)境濃度增加到閾值時(shí)，可與轉(zhuǎn)錄激活劑LasR結(jié)合，激活一系列基因，包括編碼C4-HSL信號(hào)合酶的rhlI和編碼C4-HSL受體的rhlR。

慢性肺部感染患者中分離的銅綠假單胞菌常缺乏QS，但lasR突變型菌株是最常見(jiàn)的，有報(bào)道其頻率超過(guò)30%。這一現(xiàn)象背后的機(jī)制仍然不為人所知?？赡苡幸粋€(gè)強(qiáng)大的選擇壓力，使lasR突變體可能在一定的生長(zhǎng)條件下具有生理優(yōu)勢(shì)。此外lasR突變體的出現(xiàn)也得益于QS野生型菌株產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物。既往研究報(bào)道，lasR突變體是在需要QS條件下的長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中從野生型祖先進(jìn)化而來(lái)的，與野生型親本共培養(yǎng)時(shí)具有選擇優(yōu)勢(shì)。以往研究表明，銅綠假單胞菌MDR的出現(xiàn)和QS功能之間存在相互作用。一方面，QS通過(guò)調(diào)控多藥外排泵基因的表達(dá)，促進(jìn)MDR的發(fā)生；另一方面，QS系統(tǒng)本身也受到多藥外排泵表達(dá)的影響。目前外排泵對(duì)QS的影響是否會(huì)在臨床銅綠假單胞菌菌株中形成對(duì)LasR活性的選擇壓力尚不清楚。

本研究收集了NCFB患者呼吸道分離的銅綠假單胞菌，比較了MDR和非MDR菌株的QS表型。通過(guò)全基因組測(cè)序(WGS)和進(jìn)化實(shí)驗(yàn)，研究MDR機(jī)制對(duì)lasR突變體進(jìn)化的影響。

/  研究?jī)?nèi)容  /

研究前瞻性納入為期2年的雙中心慢性銅綠假單胞菌肺部感染成人患者，入組標(biāo)準(zhǔn)為確診為NCFB且下呼吸道樣本銅綠假單胞菌培養(yǎng)重復(fù)陽(yáng)性的患者，銅綠假單胞菌感染持續(xù)14天以上。排除了與其他檢測(cè)到的病原體共定植的患者。MDR銅綠假單胞菌定義為對(duì)三種或三種以上抗假單胞菌類(lèi)藥物(如碳青霉烯類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、青霉素類(lèi)/頭孢菌素類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)藥物)的獲得性不敏感。

患者臨床特征

共97例銅綠假單胞菌慢性肺部感染患者納入分析，其中非MDR定植63株，MDR定植34株。單因素分析發(fā)現(xiàn)，與非MDR相比，MDR患者感染持續(xù)時(shí)間明顯更長(zhǎng)，先前接觸碳青霉烯類(lèi)的頻率也更高。進(jìn)一步的多變量分析顯示，只有先前碳青霉烯類(lèi)暴露可以獨(dú)立預(yù)測(cè)MDR銅綠假單胞菌株的分離(OR: 24.9, 95% CI: 5.2-156.0, p <0.0001)。

MDR分離株缺乏QS表型

每例患者選擇一個(gè)分離株確定是否為MDR，比較MDR和非MDR菌株之間的QS表型，包括信號(hào)分子（3OC12-HSL 和 C4-HSL），毒力因子（綠膿菌素和蛋白酶）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非MDR分離株相比，MDR分離株中QS控制的信號(hào)分子和毒力因子的產(chǎn)量明顯降低。且這些表型在MDR分離株中比在非MDR分離株中表現(xiàn)出更多的異質(zhì)性。總體而言，在所有樣本中，MDR分離株的QS表型均較非MDR分離株差，支持慢性肺部感染過(guò)程中出現(xiàn)QS缺陷與銅綠假單胞菌的MDR發(fā)生相關(guān)。此外通過(guò)測(cè)量MDR分離株在有或沒(méi)有3OC12-HSL的情況下生長(zhǎng)18 h后的QS控制毒力產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，降低的毒力產(chǎn)量不能通過(guò)外源性添加3OC12-HSL得到顯著補(bǔ)充，表明MDR分離株的QS表型缺乏與LasR的功能障礙有關(guān)，而不是LasI。

為了確定QS缺陷表型的出現(xiàn)與MDR特征之間是否存在進(jìn)化關(guān)系，研究分析了來(lái)自不同患者的11對(duì)分離株, 7例分離株從非MDR轉(zhuǎn)向MDR，而其他4例分離株保持非MDR。發(fā)現(xiàn)在MDR轉(zhuǎn)移患者的分離株中，復(fù)發(fā)分離株的QS表型明顯較初始分離株差；但在維持非MDR的患者中，復(fù)發(fā)株和初始株之間的QS表型沒(méi)有顯著差異。表明QS缺陷表型發(fā)生在銅綠假單胞菌株MDR發(fā)生之后。

WGS確定MDR決定因素和QS基因突變

為闡明研究人群中MDR分離株的QS缺陷表型機(jī)制，研究篩選了30個(gè)體外生長(zhǎng)速度與實(shí)驗(yàn)室菌株P(guān)AO1相似的菌株進(jìn)行WGS。這些分離株包括來(lái)自不同患者的24株分離株和來(lái)自同一患者的3對(duì)分離株。采用單核苷酸變異分析來(lái)確定測(cè)序分離株之間的遺傳親緣程度。分析結(jié)果顯示，這些分離株之間的遺傳多樣性很高，哪怕是來(lái)自同一患者的成對(duì)分離株也具有差異性。

耐藥決定因素突變結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)含有碳青霉烯酶基因的分離株；14個(gè)(93.3%)MDR分離株和11個(gè)(73.3%)非MDR分離株含有oprD的非同義突變，可能導(dǎo)致功能性oprD表達(dá)的喪失。比較MDR分離株與非MDR分離株的oprD非同義突變頻率，兩組間并無(wú)顯著差異。其他耐藥決定因素如ampC、ampR、ampD和dacB中雖然也存在非同義突變，但幾乎都是錯(cuò)義突變，并無(wú)移碼突變或者過(guò)早終止子突變，提示這些基因突變?cè)诜蛛x株的耐多藥發(fā)展中并沒(méi)有發(fā)揮主要作用。

28株分離株(14MDR分離株和14株非MDR分離株)在lasR-I和rhlR-I系統(tǒng)中存在非同義突變，與實(shí)驗(yàn)室菌株P(guān)AO1不同。rhlI是最常見(jiàn)的QS系統(tǒng)突變基因，其非同義突變存在于26個(gè)分離株中。但其突變頻率在MDR分離株和非MDR分離株之間無(wú)顯著差異。lasI 和 rhlR基因突變只存在于2個(gè)分離株中，很少見(jiàn)。8株分離株存在lasR非同義突變，且?guī)缀跞繉儆贛DR組，只有一個(gè)來(lái)自非MDR分離株。這些數(shù)據(jù)表明在lasR-I和rhlR-I系統(tǒng)中，lasR基因的非同義突變頻率在MDR分離株中顯著高于非MDR分離株。

比較MDR和非MDR的QS基因(lasR和RhlI)和外排泵調(diào)節(jié)基因(mexR、nalC、nalD、mexZ和nfxB)的同義和非同義突變頻率，并分析這些頻率之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，同義突變頻率在兩組間無(wú)顯著差異，但MDR分離株lasR、nalC和mexZ基因的非同義突變頻率顯著高于非MDR分離株。相關(guān)性分析結(jié)果表明，對(duì)于同義突變頻率，lasR與外排泵調(diào)節(jié)基因（mexR, nalC和mexZ）的呈顯著正相關(guān)，對(duì)于非同義突變，lasR僅與nalC和mexZ相關(guān)。計(jì)算這些基因的Ka/Ks比值以估計(jì)它們所經(jīng)歷的選擇壓力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDR分離株中l(wèi)asR、nalC和mexZ的Ka/Ks比顯著高于非MDR分離株。lasR的Ka/Ks比值與nalC和mexZ的Ka/Ks比值有顯著正相關(guān)性，支持MDR菌株中這些基因突變存在選擇壓力。

外排泵誘導(dǎo)的QS功能障礙的表型評(píng)估與進(jìn)化實(shí)驗(yàn)

使用外排泵抑制劑PAbN評(píng)價(jià)外排泵活性及其對(duì)QS活性的影響。是否添加PAbN對(duì)生長(zhǎng)曲線基本無(wú)影響。非MDR分離株的QS表型在添加和不添加PAbN的培養(yǎng)基中無(wú)顯著差異。MDR分離株添加PAbN后，環(huán)丙沙星、頭孢他啶和美羅培南的MIC下降超過(guò)50％；同時(shí)其QS信號(hào)和綠膿菌素顯著增加。這些數(shù)據(jù)支持外排泵活性參與了這些菌株的MDR發(fā)展，導(dǎo)致QS信號(hào)分子和毒力因子產(chǎn)量低。

為了確定外排泵素對(duì)lasR突變的選擇壓力，分別對(duì)三個(gè)擁有完整lasR序列的QS-外排泵調(diào)節(jié)突變體（分離株17、20和24）進(jìn)行了三個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化實(shí)驗(yàn)。在九個(gè)實(shí)驗(yàn)中，有七個(gè)在不同的時(shí)間出現(xiàn)了lasR突變體。為了證實(shí)群體表型歸因于外排泵活性的上調(diào)，我們通過(guò)添加外排泵抑制劑PAbN重復(fù)實(shí)驗(yàn)。QS菌株和QS缺乏菌株之間都保持了穩(wěn)定的平衡，并使MDR菌株的表型與野生型PAO1相似。

/  總結(jié)  /

1、這項(xiàng)研究是為了驗(yàn)證一個(gè)假設(shè)，即MDR的發(fā)展會(huì)對(duì)在NCFB患者定植的銅綠假單胞菌的lasR突變施加選擇性壓力。

2、臨床MDR分離株呈現(xiàn)QS缺陷表型，包括低產(chǎn)量的QS信號(hào)分子和QS控制的毒力因子。外源添加信號(hào)3OC12-HSL不能改善這些表型。

3、不同時(shí)間獲得的配對(duì)臨床分離株顯示其QS表型缺陷發(fā)生在MDR之后。WGS分析顯示，臨床MDR銅綠假單胞菌分離株外排泵活性上調(diào)，且lasR與外排泵調(diào)節(jié)基因nalC和mexZ的突變頻率呈正相關(guān)。

4、進(jìn)化實(shí)驗(yàn)表明，外排泵活性的上調(diào)促進(jìn)了MDR分離株出現(xiàn)lasR突變。

5、綜上提示，慢性肺部感染時(shí)，MDR銅綠假單胞菌上調(diào)的外排泵活性易發(fā)生lasR突變。抗QS聯(lián)合外排泵抑制劑可能是MDR銅綠假單胞菌感染的NCFB患者的一種潛在治療策略。

6、不足之處：只納入了兩個(gè)中心的人群，這可能會(huì)限制研究結(jié)果對(duì)其他中心患者人群的推廣。另外不能排除其他機(jī)制參與MDR分離株中l(wèi)asR突變體進(jìn)化的可能性，需要更多的研究來(lái)澄清。

原文鏈接：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2022.934439/full

Ding F, Han L, Xue Y, Yang IT, Fan X, Tang R, Zhang C, Zhu M, Tian X, Shao P and Zhang M (2022) Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa is predisposed to lasR mutation through up-regulated activity of efflux pumps in non-cystic fibrosis bronchiectasis patients. Front. Cell. Infect. Microbiol. 12:934439. doi: 10.3389/fcimb.2022.934439

作者：山奈 吃吃個(gè)梨   審核：Zen-Master    排版：Moro